DNA测序的常见问题

1.为什么需要5ml菌液？
答：测序需要的DNA模板量较大，每次测序反应一般需要400ng（载体及插入片断大于10K则需要更多），并且样品准备需要鉴定、遇到一次测序实验不理想还需要重做、有些样品还需要进行多次测序等等。

2.如何提供菌液？
答：您可以提供4-5ml新鲜菌液，用封口膜封口以免泄露；最好是将菌体沉淀下来（5000转/分钟），倒去上清以方便邮寄。同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破。

3.如何让制作穿刺菌？
答：用灭菌过1.5ml或2ml离心管加入LB琼脂（7g/L）斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达管底，不完全盖紧管盖适当温度培养过夜，然后盖紧盖子加封口膜，室温或4℃保存。

4.PCR产物直接测序有什么要求吗？
1）扩增产物必须特异性扩增，如果扩增产物中有非特异性扩增产物，一般难以得到测序结果；2）必须进行胶纯化；3）长度200-500左右比较合适。小余200碱基对，大于500碱基对的样品进行直接测序不合算。

5.为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶才纯化？
答：如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰。这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。大多所谓的PCR“纯化试剂盒”实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR产物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。

6.如何进行PCR产物纯化？

答：PCR产物首先必须用Agarose胶电泳，将特异扩增的条带切割下，然后纯化。我们使用MOBIO的试剂盒回收（见目录号12100-300），该试剂盒回收方法操作简便，100bp-50000bp的产物均可回收。回收产物用ddH₂O溶解。

7.PCR产物直接测序的好处？

答：1）PCR产物直接测序可以反映模板的真实情况；
2）省去克隆的实验费用和时间；
3）PCR产物测序正确的片段进行下一步克隆实验结果更有保障；
4）混合模板进行PCR的产物直接测序可以发现其中的点突变。

8.对用于测序的质粒DNA的要求有哪些？

答：对测序模板DNA的一般要求：
1）  DNA纯度要求高，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色DNA，蛋白质等；
2）  溶于ddH₂O中，溶液不能含杂质，如盐类，或EDTA等螯合剂，将干扰测序反应正常进行。

9.如何鉴定质粒DNA浓度和纯度？

答：我们使用水平琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入0.5ug/ml的EB（电泳缓冲液中不必加EB），加一个已经浓度的标准样品。电泳结束以后在紫外灯下比较亮度，判断浓度和纯度。此方法可以更直接、准确地判断样品中是否含有染色体DNA、RNA等，也可以鉴别抽提的质粒DNA的 不同构型。

质粒DNA的3种构型是指在质粒DNA过程中，由于各种原因的影响，使得超螺旋的共价闭合环状结构的质粒（SC）的一条链断裂，变成开环状（OC）分子，如果两条链发生断裂，就变成为线状（L）分子。就3种分子有不同的迁移率，通常，超螺旋型（SC）迁移速度最快，其次为线状（L）分子，最慢为开环状（OC）分子。

使用紫外分光光度计检测，或者用溴乙锭—标准浓度DNA比较法只能检测抽提到的产物中的浓度，甚至由于抽提的质粒DNA中含有RNA、蛋白质、染色体DNA等因素的干扰，浓度检测的数值也是没有多少意义的。

10.为什么抽屉的质粒需要溶解在ddH₂O中？

答：全自动荧光测序由于反应体系小，所以对于模板DNA的质量要求比手工测序高许多。通常的提取质粒的试剂盒会提供一个Elution Buffer 给用户洗脱DNA，我们建议不要使用。因为其中含有的如EDTA等组分会对测
序反应产生干扰，甚至导致测序反应失败。

11.对测序引物的要求有哪些？

答：对测序引物的一般要求：

1）  特异性与测序模板结合，不能有多于4个碱基以上的错配现象；

2）  不能含有混合碱基；

3）  长度17-25碱基；

4）  纯度高，最好PAGE纯化；

5）  用ddH₂O溶解，不要用TE溶解。

12.为什么测序引物必须特异地与DNA模板结合？

答：测序引物与待测样品DNA分子只能有一个结合位点是测序成功的前提。如果测序引物在DNA模板分子上有不止一个的结合位点，将造成测序反应过程引物链在几个结合位点处同时扩增，从而得到链长相同而组成不相同的终止链，测序电泳时收集到重叠峰或乱峰，无法读取序列。

13.为什么测序引物3’端以后有30-50碱基无法读到？

答：全自动荧光测序方法由于使用标记了大荧光染料的ddNTP，一些未反应完的ddNTP底物会连同测序反应产物一并被沉淀，在测序电泳时会干扰测序信号，导致这部分碱基无法读清。一般的我们会在分析结果时切掉这部分无意义的数据。通常这也是载体的序列。所以选取测序引物时要使引物3’端离开要求测序的起始位置50碱基以上比较合适。而对于PCR产物测序就不可避免使得测序引物区域附近无法读到数据。

14.什么时Primer Walking 测序？

答：大于1kb的样品，双向测序如果不能完全拼接，我们还可以为用户按照上一个测序结果在400-450碱基左右设计引物继续测序，并将测序结果拼接，即Primer Walking测序。我们按照实际测序的反应个数以及合成的引物碱基数收费。

15.超过6Kb的DNA片断如何进行测序？

答：超过6Kb的DNA片断用Shot Gun 进行测序准确并且节省时间，Shot Gun 方法如下：

1）  用物理方法打碎DNA；

2）  回收1-1.5K的片断；

3）  用核酸酶切平端，连接入载体；

4）  按照一定比例进行测序，保证每一个区段有3倍以上的数据；

5）  编辑所有测序数据；

6）  如果有缺少数据的区域，还需要补充测序。拼接成完整序列。

费用方面略高，请具体询价。

16.全自动荧光测序的准确性如何？

答：我们使用美国AB公司的ABI377测序仪以及配套的BIGDYE TERMINATOR SEQUENCING KTT，该测序方法以及安装仪器时用标准样品测序，准确性达到一个反应500碱基中只有1个以下的错误（即错误率小于0.05%）。如果用户得到一个测序结果的彩图时清晰的，峰型是尖的，尖峰与读取的碱基编码时一致的，那么它的准确性应该时可信的。当然如果时新序列，最好用同方向或反方向再测序一次加以验证。因为两次不同的测序，同一个碱基上的错误概率应该小于0.0025%，同时出错的可能性极小。当然由于每一份测序报告都需要人工判读分析结构，由于时间和经验等原因，不一定每一份测序报告都能够将仪器漏读、错读、多读的碱基100%的纠正过来，所以一旦您觉得有问题，请您及时与我们联系，说明您的情况，我们一定给您满意的回答。